식물 내 싸이토키닌의 생리적 역할, 대사 과정 및 신호 전달 체계에 관한 연구 doc_id PCY_201412090925020191_4

Emery등(2000)은 생장중인 루핀(Lupinus albus)의 목부와 사부 조직에서 GC-MS를 이용하여 다양한 싸이토키닌을 정량하였다. 개화시기부터 시작하여 꼬투리형성, 배발생을 거쳐 개화 후 77일에 걸쳐서 생리적으로 종자가 성숙단계에 이를 때까지 분석한 결과 개화후 처음 10일간에는 수정된 자방에서 싸이토키닌이 축적되는데 cis-CK:trans-CK isomer의 비율이 처음에는 10:1이 되다가 점차 1:1이 안되게 감소하였다. 제대로 성숙하지 못하고 쭉정이가 된 자방에서 cis-isomer와 trans-isomer 비율은 떨어지지 않고 높은 상태를 유지하였다. 꼬투리가 형성되기 시작할 때 자방 당 30~40 pmol의 싸이토키닌(이중 90% 이상이 cis-isomer)이 축적되는 것은 목부와 사부를 통한 이동 때문이라고 설명된다. Dewitte 등(1999)은 잎과 꽃을 형성하는 기관형성은 싸이토키닌 함량 증가와 연관이 있으나 꽃눈의 형성 등과 같은 전이단계에서는 싸이토키닌의 함량은 매우 낮음을 보고하였다. 그들 역시 dihydrozeatin과 isopentenyladenine은 주로 세포질에 존재하는 반면 zeatin은 핵과 관련이 있음을 발견하고 이들은 각기 다른 종류의 싸이토키닌이 대사과정의 각기 다른 과정에서 또는 다른 세포내 구획에서 역할을 할 것이라고 제안하였다. 유사한 결과를 Redig 등(1996)도 발표하였는데 이들은 동조시킨 담배 BY-2 현탁배양 세포를 이용하여 세포주기(cell cycle) 진행과 세포내 식물 호르몬 사이의 관계를 조사하였다. 그 결과 zeatin과 dihydrozeatin이 S-phase의 끝에 나타나며 각각 다른 형태의 싸이토키닌이 세포주기의 각각 다른 단계(step)에서 역할을 할 것이라는 가설을 지지하였다. Redig 등(1996)은 세포주기 진행과 체내 식물호르몬 농도의 상관관계를 동조된 담배의 BY-2 세포현탁 배양체를 이용하여 연구하였다. 16종의 싸이토키닌, IAA, ABA를 분리 정제하여 정량하였다. IAA 및 ABA에 대하여는 아무런 상관관계도 나타나지 않았다. 반대로 감수분열기 및 S phase의 마지막에 특정 싸이토키닌(zeatin 및 dihydrozeatin-type)의 sharp peak들이 나타났다. Zeatin의 N- 및 O-glucosides 등 분석된 다른 싸이토키닌의 농도는 낮은 상태로 변함이 없어서 당화되지 않은(non-glucosylated) 형태는 새로이 합성되어 증가했을 가능성을 암시한다. 이러한 발견은 zeatin 및 dihydrozeatin-type 싸이토키닌이 식물 세포주기의 진행에 특정한 조절역할을 하며 다양한 조직과 세포에서 합성되지만 잎, 특히 엽록체에서 합성됨을 암시한다. Erion과 Fox(1981)는 퓨린의 6번째 탄소가 치환된 싸이토키닌 형태에 비교적 높은 친화성을 가지고 부착되는 단백질을 밀의 생식질에서 정제하고 이것을 cytokinin-binding protein(CBF-1)으로 명명하였다. 이 단백질은 4개의 상이한 소단위체(subunit)를 가지고 있으며 SDS PAGE를 이용하여 분석한 결과, 분자량이 183,000으로 확인되었는데 4개의 subunit(tetramer) 당 하나의 싸이토키닌 분자로 saturated 되며 BAP에 대한 Kd는 5 × 10-7 molar이었다. 이 단백질은 ribosome 상이나 세포질에 자유로운 상태로 존재하였고 ribosome 상에 있는 것과 자유로운 상태의 것들의 비율은 약 3:1이었다. Affinity chromatography 연구 결과와 cross-linking 실험은 CBF-1의 특이한 부착부위는 ribosome 상에 나타남을 강력히 시사하고 있다고 하였다. 2001년 Inoue 등은 싸이토키닌의 수용체를 발견하였다고 보고하였다. 그들은 cre1(cytokinin response 1) 돌연변이체를 확인하였는데 이것은 싸이토키닌에 대하여 반응이 둔감하다. 돌연변이된 유전자 CRE1은 histidine kinase를 암호화하는데 CRE1 발현은 내부 histidine kinase SLN1이 없는 효모 돌연변이체에서 발현시키면 싸이토키닌 의존적인 표현형을 가지게 하여 CRE1이 싸이토키닌 수용체라는 직접적인 증거를 보여주었다. 또한 싸이토키닌이 CRE1을 활성화시키면 phosphorelay 신호가 시작된다는 증거도 제시하였다. 애기장대에서 싸이토키닌의 반응이 결손된 돌연변이체가 선발되었는데 이것들은 조직배양에서 세포증식이 빠르고 줄기형성이 촉진되는 것들이다. 이중 한 돌연변이체를 분리하여 cytokinin response 1-1(cre1-1)로 명명하였는데 이 돌연변이체를 조직배양에서 NAA와 kinetin을 사용하여 옥신과 싸이토키닌에 대한 반응을 조사한 결과, 야생형 식물은 kinetin에 반응하여 빠른 생장, 녹색화, 줄기형성 등 반응을 보였으나 cre1-1에서는 그러한 싸이토키닌 반응이 뚜렷하지 않았다고 한다. 싸이토키닌에 의해 유도되는 유전자들의 up-stream 지역을 분석한 결과를 보면 공통적인 motif는 type-A ARR의 전사(transcription)와 type-B ARRs의 최적 부착부위(optimum binding site)를 자극하는 ARR1/ARR2와 높은 상동성을 가진 것으로 나타났다. 기능상실 돌연변이체들에 대한 분자 유전학적 분석에 의하면 싸이토키닌 신호전달에 관련된 이 two-component의 요소들은 중복되고 중첩된 기능을 하고 있다. 따라서 이러한 가설에 의하면 싸이토키닌에 대한 식물의 반응도 싸이토키닌에 의하여 조절되는 하나의 histidine protein kinase sensor가 자신의 보존된 histidine residue를 인산화시켜 인산을 반응조절자의 하나의 보존된 aspartate residue로 이전시키면서 시작된다고 한다. 싸이토키닌이 식물에 작용하게 되는 순서는 다시 두 요소 시스템을 반복 설명하는 것이니 자세한 것은 생략한다. 처음에는 싸이토키닌 신호가 수용체의 domain에 달라붙는다. 이렇게 되면 곧 단백질의 인산화작용의 cascade가 건드려지고 결국에는 하나의 shuttle 단백질인 AHP의 인산화로 끝을 맺을 것이다. 인산화된 AHP 단백질은 핵으로 들어가서 type B ARR 단백질들을 인산화 시키며 이 단백질들은 다시 type A ARR 단백질의 합성을 시작하게 한다. 이 유전자 산물들이 다시 인산화되면 이들이 다른 effector들에 영향을 끼쳐서 싸이토키닌 반응을 유도해 낸다. 또한 여기에는 인산화된 충분한 ARR이 존재할 경우 이 시스템을 닫게 할 하나의 negative feedback loop가 있다.