축산물 및 식품 내 잔류 동물용의약품(시미아졸, 퀴놀론, 이미도캅, 초산 메드록시프로게스테론 등)의 분석법 검증, 전처리 과정 및 최적화 연구 doc_id PCY_201501090909516861_12

본 분석법은 다음의 항목을 통해서 검증되었다. 1) 특이성은 공시료 및 시미아졸 표준용액을 가한 시료를 개발된 방법으로 전처리 및 분석하여 공시료의 크로마토그램 상에 시미아졸에 해당하는 피크가 검출되지 않음으로 확인하였다. 2) 직선성은 꿀 시료에서 잔류허용기준을 포함하는 0.03 ～ 1.03 mg/kg 범위에서 상관계수 (r)가 0.999로 확인하였다. 3) 회수율의 확인을 위하여 시미아졸의 농도가 잔류허용기준 기준 (1.0 mg/kg)의 0.5, 1, 2배 농도가 되도록 시미아졸 표준용액을 첨가한 시료를 각각 6회 반복하여 분석하였다. 회수율은 공시료를 전처리한 뒤 마지막 과정에서 표준용액을 첨가한 시료와의 비교를 통하여 구하였다. 꿀에 대한 회수율과 분석오차는 각각 82.6～92.1%와 5% 미만으로 동물용의약품 분석법 기준을 충분히 만족하며 축산물 중 잔류허용기준에 대하여 정확한 적부판정을 수행할 수 있다. 4) 정량한계는 크로마토그램 상에서 대상 피크의 신호대 잡음비가 10인 농도로 정하였다. 본 분석법의 정량한계는 꿀에서 20 μg/kg으로 나타났다. 시료 (쇠고기 또는 우유)의 전처리를 위하여, 시료 5 g (우유 5 mL) 에 acetonitrile 20 mL과 MgSO4 2 g (우유 3 g) 를 가하고 10분간 shaking 한 후 4,500 rpm에 서 10분간 원심분리 하여 상등액을 취한다. 원심분리 잔사에 다시 acetonitrile 10 mL를 가하여 추출을 반복한다. 2차 추출에서 얻은 상등액을 이전의 상등액과 합한 뒤, 감압농축하여 hexane 5 mL로 재용해하여 Florisil SPE 카트리지에 loading 한다. 미리 hexane 5 mL로 활성화 시킨 카트리지에 추출물을 흡착시키고, hexane 10 mL로 세척한 후 60% dichloromethane을 함유한 hexane 10 mL로 용리시킨다. 용리액은 감압농축 후, acetone 2 mL로 재분산 하여 GC-ECD 분석용 시료로 사용한다. 퀴놀론 항생제를 LC-MS/MS로 분석하기 위하여 ESI (electrospray ionization) 방법의 positive ion mode를 적용하고, positive ion mode에서 퀴놀론 항생제들의 이온화를 증가시키기 위해 0.1% formic acid 수용액을 이동상 A로 사용하였다. 분석의 선택성과 검출감도를 향상시키기 위하여 MS/MS 분석 시 MRM (multiple reaction monitoring) mode로 분석한다. 이 때 collision cell에서 collision energy를 조절하여 product ion의 response가 최대가 되도록 조정하여 정성 및 정량의 precursor/product ion pair를 선정하였다. 본 분석법은 다음의 항목을 통해서 검증되었다. 1) 특이성은 공시료 및 이미도캅 표준용액을 가한 시료를 개발된 방법으로 전처리 및 분석하여 공시료의 크로마토그램 상에 이미도캅에 해당하는 피크가 검출되지 않음으로 확인하였다. 2) 직선성은 쇠고기 및 우유 시료에서 잔류허용기준의 0.5 ∼ 5배 (150～1500 μg/kg : 쇠고기, 25～250 μg/kg : 우유) 범위에서 확인하였다. 3) 회수율의 확인을 위하여 이미도캅의 농도가 잔류허용기준의 0.5, 1, 2배 농도가 되도록 이미도캅 표준용액을 첨가한 시료를 각각 5회 반복하여 분석하였다. 회수율은 공시료를 전처리한 뒤 마지막 과정에서 표준용액을 첨가한 시료와의 비교를 통하여 구하였다. 쇠고기 및 우유에 대한 회수율과 분석오차는 각각 80.3 6～89.52%와 10% 미만으로 동물용의약품 분석법 기준을 충분히 만족하며 축산물 중 잔류허용기준에 대하여 정확한 적부판정을 수행할 수 있다. 4) 정량한계는 크로마토그램 상에서 대상 피크의 신호대 잡음비가 10인 농도로 정하였다. 본 분석법의 정량한계는 쇠고기에서 150 μg/kg, 우유에서 25 μg/kg으로 잔류허용기준의 0.5배이다. 초산 메드록시프로게스테론 (medroxyprogesterone 17-acetate) 은 합성 프로게스테론으로 피임, 호르몬 대체요법, 자궁내막증 및 다른 증상의 치료에 사용되는 약물이다. 이러한 합성호르몬 약물은 동물 사육에 growth promoter로 널리 이용되었는데, 사람의 몸에 독성을 나타낼 가능성이 있어 식용 동물에 사용이 금지되었다. 이 약물은 urine, feces 또는 kidney fat에 축적되는 경향이 있어 신장 시료 중 모니터링이 중요하나, 신장 시료의 확보가 어려워, 확보가 용이한 근육 시료를 대상으로 분석법을 개발하였다. 초산 메드록시프로게스테론의 분석에 과거 heptafluorobutylic anhydride를 이용한 유도체화 및 GC-ECD가 이용이 된 보고가 있었으나, 유도체화의 번거로움 및 이에 의한 오차 발생 가능성 때문에 고려대상에서 제외 되었고, LC-UV에 의한 초산 메드록시프로게스테론의 분석 사례도 존재하나, 감도가 5 ng/mL로 제한되어 고려 대상에서 제외 되었다. 쇠고기 중 초산 메드록시프로게스테론 (medroxyprogesterone 17-acetate) 추출을 위하여 acetonitrile, methanol, acetone, ethyl acetate, tertiarybutylmethylether, chloroform, acetone 및 이들의 혼합용매를 사용하여 추출을 하였을 때 acetone이 가장 좋은 추출률을 보였으나, 다운스트림에서의 질량분석 시, 목적 성분과 동시에 용리되는 간섭 물질에 의한 ESI 이온화중 ion suppression이 확인 되었다. Ion suppression은 ESI 이온화 중 특정 물질이 동시에 존재하는 다른 물질에게 분무된 droplet의 표면 전하를 빼앗겨 이온화 효율이 낮아지는 현상으로, 해당 성분의 감도가 낮아지게 된다. 따라서, 초산 메드록시프로게스테론 (medroxyprogesterone 17-acetate) 을 acetone으로 추출했을 경우, 결과적으로 감도가 낮아지는 문제점이 발견되었다. 초산 메드록시프로게스테론의 ESI 중 ion suppression 원인 물질의 제거를 위해 SPE를 이용한 acetone 추출액 중 초산 메드록시프로게스테론 의 정제를 진행 하였고, SPE 카트리지 고정상으로는 OASIS HLB를 이용하였다. 이는 일반 실리카 기반의 C18 및 C8 카트리지 고정상에서 관찰된 초산 메드록시프로게스테론의 고정상 중 잔류에 의한 소실이 HLB 카트리지 고정상에서 관찰되지 않았기 때문이다. 또한 추출액 중 지방 성분의 제거를 위해, SPE loading 후 hexane을 이용한 세척의 수행 시, HLB 카트리지를 사용한 경우에서만 초산 메드록시프로게스테론이 용리되지 않고, 카트리지에 유지 되는 것으로 확인되었다. 상기된 결과는 hydrophilic monomer와 hydrophobic monomer를 모두 포함하는 고분자 형태의 고정상을 갖는 HLB의 특성에 기인한다.