초산 메드록시프로게스테론, 툴라스로마이신, 카프로펜 및 그 대사체의 분석법 개발과 검증에 관한 연구 doc_id PCY_201501090909516861_13

본 분석법은 다음의 항목을 통해서 검증되었다. 1) 특이성은 소고기에 분석물질을 첨가하여 전처리한 시료 (0.004 mg/kg), 소고기에 분석물질을 첨가하지 않은 공시료를 전처리한 시료를 분석하여 공시료의 크로마토그램 상에 초산 메드록시프로게스테론에 해당하는 피크가 검출되지 않음으로 확인하였다. 2) 직선성은 LOQ의 1 ∼ 6배 농도 (2 ∼ 12 ng/g) 에 해당하는 구간에서 확인하였다. 3) 회수율과 정량 한계의 확인을 위하여 시료 중 초산 메드록시프로게스테론 LOQ의 1, 2 배 농도가 되도록 spike한 쇠고기 시료의 전처리를 각각 5회 반복하여 분석하였다. 회수율은 표준 농도와의 비교를 통하여 CAC/GL 16 규정에 적합함을 확인하였고, 정량 한계는 크로마토그램 상에서 분석 대상 피크의 신호대잡음비가 10인 농도로 정하였다. 또, 회수율 시험 결과를 통해 정밀도와 정확도도 CAC/GL 16 규정에 적합함을 확인하였다. 툴라스로마이신의 추출 시 쇠고기와 돼지고기에 일반 LLE 시료전처리 방법을 적용하였을 때 방해효과를 확인할 수 있기 때문에 고체상추출법을 적용하여 정제과정을 거치는 것이 좋다. HLB(Hydrophilic-Lipophilic Balance)카트리지를 사용할 경우 산성조건으로 재분산한 시료를 주입하여 부착한 후 염기성 조건으로 추출해내어 방해효과를 제거할 수 있다. 또한, 추출한 시료를 건고하고 methanol, 3차 증류수, 이동상 등으로 재분산하여 적용해 보면 3차 증류수로 재용해 한 시료에서 가장 좋은 회수율을 보여준다. 툴라스로마이신의 분석법으로 ESI (electrospray ionization) 방법의 (+) ion mode 을 적용한다. 고정상으로는 극성물질 분석에 좋은 성능을 나타내는 UG120 칼럼 (2.0 x 150 mm, 5 μm)을 사용하고, 이동상으로는 0.1% formic acid 수용액과 0.1% formic acid acetonitrile용액을 기울기 용리하면 분석 성분이 6분 이후에 분리 검출되도록 할 수 있다. 분석의 선택성과 검출감도를 향상시키기 위하여 MS/MS 분석 시 MRM (multiple reaction monitoring) mode로 분석한다. 이 때 Q1 tune mode 상태에서 최적의 파라미터를 구하여 precursor/product ion pair를 선정하고 가장 좋은 감도를 보이는 product ion을 정량 이온 (quantitation ion)으로 설정하고 다음으로 크게 검출되는 product ion을 정성 이온 (qualification ion)으로 설정하여 확인한다. 툴라스로마이신의 표준품은 methanol에 녹여 1000 μg/mL 농도의 표준용액으로 만들어 4℃의 온도에서 보관하고, 이 용액을 100% methanol 용액으로 희석하여 사용한다. 내부표준물질인 아지스로마이신은 methanol에 녹여 1000 μg/mL 농도의 용액으로 만들어 4℃의 온도에서 보관하고, 이 용액을 100% methanol 용액으로 희석하여 사용한다. 본 분석법은 다음의 항목을 통해서 검증되었다. 1) 특이성 톨라스로마이신 분석법의 특이성을 평가하기 위하여 공시료와 표준물질을 가한 공시료를 개발된 분석법에 따라 LC-MS/MS로 분석하여 얻어진 크로마토그램을 비교하였다. 그 결과 톨라스로마이신의 머무름 시간은 약 6.5 분이었다. 적용된 분석법의 선택성을 평가하기 위하여 각 검량선 작성시 공시료를 분석하였을 때, 주 피크의 정량에 방해를 줄 수 있는 피크는 검출되지 않았다. 2) 직선성은 기준치의 0.5 ～ 5 배 농도에 해당하는 구간에서 확인하였다 3) 회수율과 정량 한계의 확인을 위하여 시료 중 툴라스로마이신의 농도가 기준치의 0.5, 1, 2 배 농도가 되도록 툴라스로마이신 표준용액을 첨가한 쇠고기와 돼지고기 시료를 각각 5회 반복하여 분석하였다. 회수율은 표준 농도 (matrix-matched standard)와의 비교를 통하여 CAC/GL 16 규정에 적합함을 확인하였고, 정량 한계는 크로마토그램 상에서 분석 대상 피크의 신호대잡음비가 10인 농도로 정하였다. 또, 회수율 시험 결과를 통해 정밀도와 정확도도 CAC/GL 16 규정에 적합함을 확인하였다. 카프로펜은 비스테로이드성 소염진통제로 주로 동물의 관절염이나 관절의 통증의 치료에 사용되는 약물이다. 카프로펜은 체내에서 글루쿠로나이드 (glucuronide) 대사체로 대사되어 배설되며 유럽 공정서에서는 카프로펜과 카프로펜의 글루쿠로나이드 대사체 모두를 분석대상으로 선정하고 있다. 추출 과정에서 methanol, ethanol, acetnonitrile 등의 추출용매를 사용하여 회수율을 검토하여 보았다. 그 결과 acetonitrile을 사용하였을 때 회수율이 가장 좋았고, 회수율을 향상시키기 위하여 추출 과정을 2회 반복하였다. 질소기류하에서 농축 후 재분산 과정에서 재분산 용매인 methanol의 최종 용량이 1 mL로 사용한 추출용매의 양보다 적어 질소퍼지용 튜브내벽의 카프로펜을 충분히 재용해할 수 없었다. 따라서 methanol 3 mL로 재분산을 선행한 후 다시 질소퍼지 하고 최종적으로 methanol 1 mL로 재분산하여 회수율을 높일 수 있었다. 카프로펜 글루쿠로나이드 대사체의 정량은 카프로펜 글루쿠로나이드 (carprofen glucuronide)의 표준품을 이용하여 각각 정량하는 방법과 카프로펜 글루쿠로나이드 대사체를 가수분해하여 카프로펜으로 변환 후 이를 정량하는 방법이 있다. 카프로펜 글루쿠로나이드의 가수분해에는 글루쿠로나이드 가수분해 효소인 glucuronidase를 이용하는 방법 또는 산을 이용한 가수분해 방법을 사용할 수 있다. 이 분석법에서는 카프로펜 글루쿠로나이드를 가수분해하여 이를 카프로펜으로 변환 하여 분석하는 방법을 적용하였으며, 강산을 이용한 가수분해 방법을 채택하였다. 시료를 추출한 용액에 10 mM Sodium ascorbate buffer (pH 3.0) 10 mL와 1.0 M Hydrochloric acid 0.2 mL를 가하고 상온에서 10분간 vortex하여 가수분해한다. 이때 생성된 가수분해 산물의 안정화를 위하여 sodium ascorbate buffer를 위하여 첨가한다. 카프로펜은 분자내에 발색단을 포함하여 HPLC-UVD를 이용한 분석이 가능하나, 이 방법을 적용할 경우 매트릭스 성분의 간섭이 우려되며, 고감도 분석이 어려운 단점이 있다. 따라서, 분석법의 선택성과 분석의 감도를 높이기 위하여 HPLCFLD를 이용한 분석법을 개발하였다. 고정상으로는 피크의 모양이 좋고과 매트릭스의 간섭성분 카프로펜의 분리가 양호한 Phenomenex Luna C18 칼럼 (150 x 4.6 mm, 5 μm)을 사용하였다. 이동상으로 0.1% phosphoric acid/acetonitrile (50/50, v/v)을 사용하고, isocratic elution 하였을 경우 분석대상성분이 5분 이후에 분리 검출되었다. 카프로펜 표준품은 methanol에 녹여 1000 μg/mL 농도의 표준용액으로 만들어 -20℃의 온도에서 보관하고, 이 용액을 methanol로 희석하여 2.5, 5, 10, 15, 20, 25 μg/mL 농도의 working standard solution을 만든다.