식품 내 잔류 성분 분석을 위한 검체 채취, 전처리(추출 및 정제), 그리고 기기 분석법의 단계별 과정과 방법론 doc_id PCY_201501090909516861_15

메타미졸의 분석법으로 ESI (electrospray ionization) 방법의 (+) ion mode을 적용한다. 고정상으로는 SeQuant사의 ZIC-HILIC 칼럼을 사용하고, 이동상으로는 0.1% formic acid 용액과 acetonitrile용액을 기울기 용리하면 분석 성분이 10분 이내에 분리 검출된다. 분석의 선택성과 검출감도를 향상시키기 위하여 MS/MS 분석 시 MRM (multiple reaction monitoring) mode로 분석한다. 메타미졸의 표준품은 methanol에 녹여 1000 μg/mL 농도의 표준용액으로 만들어 4℃의 온도에서 보관하였고, 이 용액을 acetonitrile로 희석하여 사용한다. 내부표준물질인 DAP (4-Dimethylamino antipyrine)는 methanol에 녹여 1000 μg/mL 농도의 용액으로 만들어 4℃의 온도에서 보관하였고, 이 용액을 acetonitrile로 희석하여 사용한다. 본 분석법은 미 농무성 산하 식품안전조사국 (FSIS)에서 개발된 스크리닝 분석법을 참고하여 개발하였다. 이 분석법에서는 일반적인 QuEChERS법에서 salting-out과정을 생략한 modified-QuEChERS법을 사용하였다. 시료의 정제를 위하여 C18 흡착제를 사용하여 dSPE 과정만 실시하였으며, hexane을 이용하여 지방을 제거하였다. 또한 재용해의 효율을 높이기 위하여 methanol을 이용하여 먼저 용해 시킨 후 0.1% formic acid를 가하고 sonication하였다. 또한, 다수의 시료에 함유되어 있는 여러 가지 성분을 빠른 시간내에 분석하여야 하는 스크리닝 분석의 특성을 고려하여 일반적인 HPLC 보다 분리 효율이 뛰어난 UHPLC를 이용하여 모든 성분이 10분 이내에 분리되도록 분석법을 설정하였다. UHPLC에서는 보통 2 μm 미만의 particle size를 갖는 칼럼을 사용한다. 이는 시료 및 이동상에서 유래한 미세한 particle에 의하여 막힐 수 있으므로 조제 시 0.2 μm의 membrane filter를 사용해 여과하여 particle의 유입을 방지한다. 검체 채취는 잔류 물질 분석의 첫 번째 단계로서 모집단에 대한 분석결과의 대표성과 타당성을 좌우하는 매우 중요한 과정이다. 분석 대상 검체는 잔류 수준 및 위해성의 조사, 평가를 위해 분석이 요구되는 모든 식품이 포함된다. 검체는 대상 모집단의 특성을 잘 반영할 수 있도록 대표 검체의 형태로 채취하여야 한다. 즉, 모집단 전체에서 무작위성을 충분히 반영하면서 평면적으로 또는 공간적으로 균일하게 채취하여야 한다. 검체 채취 방법은 모집단의 크기, 장소, 전수/발췌 조사 또는 검사 목적에 따라 매우 다양하므로 해당 분야나 기관에서 별개로 정한 기준을 준수하도록 한다. 대부분 잔류 검사의 목적이 분석 결과의 공적, 법적 사용이므로, 통계에 기반한 검체 채취 단계의 관리는 결과의 신뢰도 확보에 매우 중요하다. 이외에도 시료채취 시 유의해야 할 사항으로는 분석 목적에 적합한 시기와 장소에서 검체 채취, 분석 대상 물질이 처리되지 않은 검체 확보 (분석 방법 검증 시 필요) 등이 있다. 또한 잔류 물질 분석을 위한 검체 채취 작업 중 교차오염 (cross contamination) 이 발생하지 않도록 주의하여야 하는데, 하나의 대표 검체 마다 별개로 채취 작업을 수행하여 검체 간 상호오염을 예방할 수 있다. 식품 중 잔류 성분에 대한 화학적 분석법의 과정은 다음의 다섯 단계로 진행된다. 채취한 식품 검체를 분석용 검체의 형태로 전처리하는 과정이다. 주로 식용으로 사용되는 가식부를 위주로 하나 분석 부위와 반드시 일치하는 것은 아니다. 분석용 검체로부터 분석 대상성분을 추출하는 과정으로 분석 대상성분은 모화합물을 주 대상으로 하며 그 외 독성학적 중요성이 인정되는 불순물 및 분해대사산물이 추가된다. 대상성분들에 대한 기기분석이 가능하도록 검체 추출물(액)을 정제하는 과정으로 추출물 중 분석 방해물질을 제거함을 목적으로 한다. 일반적으로 분석 과정 중 가장 많은 시간과 노력이 요구되는 과정으로, 분석 대상 물질과 간섭물질간의 물리화학적 특성 차이에 근거한 분리를 이용한다. 분석기기를 이용하여 추출 정제액에 함유된 대상성분을 분석 (정성 및 정량 분석) 하는 과정이다. 일상적으로 가장 많이 사용되는 분석기기는 GC와 HPLC이며 검출기로는 질량분석기가 최근에 주로 이용되는데, 대상성분의 함량이 극미량이며 정제액이라 하더라도 상당수의 간섭물질이 여전히 포함되어 있어 질량분석기의 고감도와 검출 선택성이 필요하기 때문이다. 개별 분석법은 개별 동물용의약품성분별로 최적화시킨 분석법으로 다성분 분석법에 비하여 상대적으로 분석의 효율은 낮으나 최고의 분석 감도, 정밀성 및 신뢰도가 보장된다. 따라서 어떠한 검체의 다성분 검색 결과 검출된 의심성분을 보다 정확히 정성 및 정량하며, 특히 법적 및 행정적 목적으로 분석의 신뢰성이 요구될 때 이용된다. 또한 다성분 분석법에 포함시킬 수 없는 성분들에 대하여는 각각의 개별 분석법이 개발 적용된다. 이러한 두 분석체계간 보완적 특성에 따라, 식품의약품안전처에서는 33개의 다성분 분석법과 더불어 77개의 개별 분석법을 고시하여, 두 분석법체계를 함께 운용하고 있다. 나타낸 바와 같이, 잔류 분석의 경우, 분석 전 시료 추출 및 정제의 과정이 필수이고, 대상 검체에 따라 추출효율, 방해물질의 종류 및 양이 매우 상이하므로 식품군별에 따라 특화된 추출 및 정제법이 사용되는 경우가 많다. 식품 검체 추출에 사용되는 일반적인 용매 추출법이 정리되어 있다. 수분을 다량 함유하고 있는 검체의 경우 대부분의 중성 잔류분은 검체 입자 표면이나 내부에 존재하고 그 주위가 수분으로 수화되어 있기 때문에 물과 섞이지 않는 비극성 유기용매를 직접 사용할 경우 검체 내부로의 침투성이 낮아 충분한 추출 효율을 얻을 수 없다. 따라서 acetone, acetonitrile, methanol과 같은 수용성 유기용매를 주로 사용한다. 일반적으로 건조된 검체의 경우는 건조된 상태에서는 수용성 유기용매에 의한 추출효율이 낮고, 비극성 성분에 대한 흡착성이 다소 강한 편이므로, 추출 전에 일정량의 수분을 첨가하여 습윤화한다. 물과 섞이지 않는 비극성 유기용매로 직접 추출하고자 할 때에는 검체에 다량의 건조제 (무수 sodium sulfate 등)를 가한 후 혼합하는 탈수과정이 추출에 앞서 필요하다. 검체에 추출용매를 넣고 초음파의 고속 진동을 이용하여 동물용의약품성분을 추출하는 방법이다. 주로 초음파세척기를 이용하여 5∼30분간 추출한다. 조작이 쉽고 추출 시간을 단축할 수 있으나 대상성분 및 검체 종류에 따라 회수율과 재현성이 일정하지 않은 단점이 있다. 또한 가연성 용매를 사용할 경우 발화의 위험이 있다. 고체나 반고체상태의 시료를 가온, 가압상태에서 소량의 유기용매와 수용성 용매만을 사용하여 신속하게 추출할 수 있는 매우 효율적인 추출법이다. 특수하게 설계 제조된 별도의 추출기를 이용하며 고온과 고압에 견디도록 만들어진 금속성의 추출셀에 검체를 채우고 온도 (100℃)와 압력 (1,500∼2,000 psi)을 증가시키면서 용매를 흘리게 되면 추출용매의 점도, 확산성, 용매강도, 용해도 등 용매의 물리적 특성이 추출에 적합하도록 변화되면서 추출 효율이 증가하므로 추출 효율이 매우 높은 것이 특징이다. 주로 수분함량이 적은 고체 검체에 적용이 가능하며 수분이 많은 검체의 경우에는 추출 전 동결건조 등의 방법으로 검체 중 수분을 제거하는 것이 필요하다. 전처리 중 발생되는 유기용매에 의한 환경오염과 유해한 유기용매에 분석자의 장시간 노출문제를 저감화할 수 있어서 최근에 이용 예가 늘어나고 있다.