동물용의약품 및 잔류 성분의 효율적인 추출과 유도체화를 통한 정밀 분석법 개발 doc_id PCY_201501090909516861_17

할로푸기논은 포자충에 의한 전염병인 콕시디아증에 사용되는 약물이다. 일부 콕시디아증 치료제는 돌연변이원 (mutagen), 잠재적 발암성 (potential carcinogen), 신경 독성 등을 갖는 것으로 알려져 있다. 또한, 이 동물용의약품은 거울상 이성질체 화합물로 trans-halofuginone과 cis-halofuginone이 공존하며, 이 중 trans 이성질체가 약효를 갖는 것으로 알려져 있다. Cis 이성질체의 경우 impurity로 존재하지만 일반적인 역상 액체크로마토그래프 조건에서는 이들 거울상 이성질체는 분리되지 않는다. 시료의 추출과정에서 methanol, ethanol, acetonitrile, 5% trichloroacetic acid (inwater) 등의 추출용매를 사용하여 회수율을 비교하여 보았다. 추출 용매로 acetonitrile을 사용하였을 때 회수율이 가장 좋았으며, 추출 과정을 2회 반복하여 충분한 추출이 이루어지도록 하였다. 균질화한 쇠고기 및 닭고기 검체에 acetronitrile을 가하여 2회 vortexing하여 추출하고 원심분리하여 상등액을 모두 모아 질소기류하에서 건고 한다. 이를 water/acetonitrile (1/1, v/v) 용액으로 재용해한 후 물을 가한다. 이를 Oasis HLB 카트리지를 사용하여 고체상 추출하여 정제하고 LC-MS/MS로 분석한다. 우유 검체는 acetonitrile과 sodium sulfate를 가하여 2회 추출하고 원심분리하여 상등액을 모두 모아 질소기류하에서 건고 한다. 이를 water/acetonitrile (1/1, v/v)용액으로 재용해한 후 물을 가한다. 이를 Oasis HLB 카트리지를 사용하여 고체상 추출하여 정제하고 LC-MS/MS로 분석한다. 약산 또는 약염기성 대상성분에 대해서는 2가지의 추출법을 사용할 수 있다. 하나는 이온억압 (ion-suppression) 조건으로 조절하여 비이온화 지용성 화합물 형태가 되도록 한 후 비극성 유기용매로 추출하는 방법이다. 즉 약산 화합물의 경우 검체나 추출용매의 pH를 pKa와의 1.5이상의 차이를 둔 산성조건으로 조절하면 95%이상이 이온억압상태가 되고 대상 화합물은 지용성 특성을 갖도록 하는 것이다. 약염기성화합물의 경우는 반대로 짝산 pKa와의 1.5이상의 차이를 두는 염기성 조건으로 조절하면 된다. 다른 하나의 방법은 이온억압과는 반대로 완전 이온화 상태로 검체나 추출용매의 pH를 조절하여 이온상태의 대상 화합물을 수용성 용매로 추출하는 방법이다. 그러나, 화합물의 안정성을 위하여 강산 및 강염기 조건은 사용하지 않는 것이 좋고, 부득이한 경우에는, 염 첨가를 통해 이온 강도를 높여, 이온억압 효과 증대를 꾀하고, 그 결과, 추출 효율을 향상시킬 수 있다. 수립된 시료 (쇠고기, 돼지고기, 또는 닭고기) 전처리 방법은 다음과 같다. 균질화된 시료 5 g을 유도체화 시킨 후, acetonitrile 15 mL를 가하고, 10분간 vortexing한다. 이를 3,500 rpm에서 10분간 원심분리하고 상층액을 새로운 tube에 모은다. 남은 침전물에 다시 acetonitrile 10 mL를 가한 뒤, 10분간 vortexing하고 이를 3,500 rpm에서 10분간 원심분리한 후 상층액을 이전의 상층액과 합하여 추출액으로 한다. 추출액에 hexane 20 mL를 넣고 3,500 rpm에서 10분간 원심분리하여 하층액을 질소퍼지용 튜브에 모은 뒤 60°C 질소 기류 하에서 건고한다. 이를 water/acetonitrile (50/50, v/v) 용액 5 mL로 재분산하고, 이 용액을 13,000 rpm에서 10분간 원심분리 한 후, 0.2 μm syringe filter로 여과한 뒤 20 μL를 HPLC-FLD에 주입한다. 표준용액의 조제를 위해, 피페라진 표준품을 물에 녹여 (1000 μg/mL) 실온에서 보관하고, 이 용액을 0.1% triethylamine 용액으로 희석하여 acetonitrile에 녹인 dansyl chloride 용액 (0.5 mg/mL) 과 1:1로 혼합한 뒤, 암실에서 40℃, 30분간 유도체화 시켜 사용한다. 표준 시료를 조제하기 위하여, 피페라진 표준용액을 0.1% triethylamine 용액으로 계열 희석하여 50, 100, 150, 200, 250, 300 ng/mL가 되게 하고, acetonitrile에 녹인 dansyl chloride 용액 (0.5 mg/mL) 과 1:1로 혼합한 뒤, 암실에서 40℃, 30분간 유도체화 시켜 농도가 25, 50, 75, 100, 125, 150 ng/mL이 되도록 하였다. 이 용액들을공시료 시료 (쇠고기. 돼지고기, 또는 닭고기) 5 g에 500 μL씩 각각 가하여 matrix 중 각 성분의 농도가 LOQ의 1, 2, 3, 4, 5, 6 배가 되도록 표준 시료를 만든다. 각각의 표준 시료는 시료 전처리 방법에 동일하게 적용시켜 전처리 한다. 피페라진 (piperazine) 은 동물용 구충제로 인체 독성으로 인해 한국, 미국, 유럽, 일본 등지에서 잔류 허용 기준을 정해서 규제하고 있다. 피페라진은 일반적인 발색단을 갖지 않으므로, 일반적인 UV/VIS 흡광 실험 영역에서 흡광을 보이지 않는다. 따라서, 일반적 인 HPLC-UVD를 이용한 분석이 불가능하다. 이에, 피페라진의 amine 기에 형광 특성을 갖는 dansyl기를 붙인 후, HPLC-FLD를 이용하여 분석하는 방법을 개발하였다. 이동상으로 water/acetonitrile isocratic elution을 사용, 분석대상 성분이 5분 이후에 분리 검출되고, 유도체의 형광 광도를 이용하므로, 분석의 선택성과 검출감도도 우수하다. 피페라진 추출을 위한 최적 용매를 선정하기 위해 methanol, ethanol, acetnonitrile 등의 피페라진 추출 효율을 비교하였는데, acetnonitrile의 추출 효율이 가장 우수했으며, 2회 반복 작업을 통해 보다 향상된 추출 효과를 획득할 수 있었다. 그러나, acetonitrile 추출액의 질량분석 시, 간섭 물질에 의한 분석 방해가 확인되어, hexane을 이용한 2차 추출을 적용하여, 이를 해결하였다. carbamate계 화합물인 페노부카브는 전세계적으로 농약과 쇠고기, 돼지고기, 닭고기 등의 동물용의약품으로 사용되고 있는 살충제이다. 페노부카브의 분석 가능 장비로는 GC-NPD, HPLC-UVD, FLD, MS/MS 등이 있으나 GC-NPD와 HPLC-UVD로 분석을 수행할 시 검출한계 ≥ 20 ng/g (일본의 MRLs)으로 기기상의 감도가 많이 떨어진다. 형광반응시약과 가수분해시약(NaOH)를 이용하여 페노부카브를 포스트컬럼형광반응(유도체화)한 후 HPLC-FLD로 분석하면 15 ng/g 수준의 검출한계를 구할 수 있다. 분석 컬럼으로는 가장 흔히 사용 되는 역상 컬럼 중 Shimadzu사의 VPODS 칼럼(4.6 x 250 mm, 5 μm)을 사용하고 이동상으로는 3차 증류수와 methanol을 사용하였고 기울기용리로 대상성분이 5분 이후에 분리 검출되도록 할 수 있다.