잔류동물용의약품 분석을 위한 검체 채취, 추출 및 다양한 정제 방법론에 관한 설명 doc_id PCY_201501090909516861_3

TLC의 원리는 column chromatography와 동일하나, 형태상 겔 침투 및 이온교환의 분리 양식은 적용하기 힘들며 주로 흡착과 분배가 분리 원리이다. 고정상을 얇게 입힌 TLC판에 소량 (약 0.5 mL)의 휘발성유기 용매에 용해한 검체를 모세관이나 미세주사기를 이용하여 TLC판 하단 약 3cm 높이에 소량씩 점적 (spot) 또는 띠모양 (band)으로 떨어뜨리고 공기나 질소기류 하에서 건조시킨다. 이때 분석 대상성분의 표준 용액을 대조구로 판의 별도의 위치에 함께 처리한다. 검체를 처리한 TLC판은 전개용매가 담긴 chamber에 넣고 뚜껑을 덮어 밀폐하면 전개용매가 모세관 현상에 의하여 흡착제를 적시면서 판을 상승한다. 약 10∼15 cm 상방 전개 후 판을 꺼내어 건조하고 자외선을 조사하거나 발색시약을 사용하여 표준물질의 전개위치를 확인한다. 표준물질의 Rf값을 기준으로 분석 대상 동물용의약품에 해당하는 부위를 긁어내어 적당량의 유기용매로 추출한 후 기기분석에 적용한다. TLC는 그 검체 처리과정이 다소 번거롭고 검체 주입량도 제한적이기는 하나 좁은 장소에서 한 번에 다수의 검체를 간편하게 정제할 수 있다는 장점이 있다. 분리 효율은 우수한 편이며 간섭물질의 양이 비교적 적은 다수 검체의 정제에 편리하다. 고전적인 크로마토그래피의 형태로 보통 유리관에 고정상을 충전하고 이동상을 상부로부터 흘려보내는 크로마토그래피 형태로, 잔류 물질 분석에서는 중성 (일부 약 이온성 포함) 대상성분의 기기분석을 위한 최종 정제과정으로 널리 이용되어 왔다. 고정상으로는 alumina, Florisil, silica gel 및 활성탄 등이 사용된다. Florisil은 magnesia (MgO)와 silica (SiO2)를 혼합, 용융하여 제조한 합성 고정상으로, 유지 및 색소의 비용출성이 우수하여 널리 사용된다. Silica gel 역시 많이 사용되는데, 극성의 화합물을 쉽게 용출시킨다는 점이 장점이다. Florisil과 silica gel은 일반적으로 약 130℃에서 5시간 이상 가열하여 입자 표면 중 수분을 제거, 활성화시킨 후 사용되는데, 일부 방법에서는 적량의 물 (약 1∼2%)을 첨가하거나 극성용매를 미리 흘려 (pre-washing 또는 pre-wetting) 극성 물질에 대한 친화력을 다소 약화시켜 사용하기도 한다. 사용되는 입자의 크기는 Florisil의 경우 60∼100 mesh 이며 silicagel의 경우는 방법에 따라 다소 상이하나 70∼230 mesh의 입자가 주로 사용된다. 고상추출법 (SPE)은 column chromatography와 분리에 이용되는 원리는 동일 하나, 소형 column을 카트리지 형태로 상용화시킨 것이다. SPE에서는 흡착, 분배 및 이온교환 등 구조적으로 적용하기 힘든 겔 침투를 제외한 chromatography의 3가지 분리 원리를 다량하게 이용하고 있다. 일반적으로 카트리지는 1, 3, 6, 10 mL 용량의 주사기 모양을 하고 있고, 충진되어 있는 고정상의 양은 100∼1,000 mg 범위이다. SPE에서 가장 중요한 사항은 대상성분과 검체의 종류에 따라 적절한 분리 원리의 SPE를 선택하는 것이다. 상용화되어 있는 주요 SPE 카트리지의 분리 원리 및 충전제의 작용기가 정리되었다. 예를 들어 검체 중 극성 불순물이 많을 경우에는 styrene-divinylbenzene copolymer로 충전된 SDVB나 HLB 카트리지를 사용하여, 용매의 비극성도를 순차적으로 높여가며 정제 (역상 조건) 하는 것이 유리하다. 대개의 SPE는 사용전 충전제 중 작용기를 표면으로 노출시켜 분리효율을 높이기 위한 활성화 (activation) 과정이 필요하다. QuEChERS (Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged and Safe) 법은 일종의 기계적 진탕 추출법, LLE 정제법, dSPE 정제법의 복합체이다. 시료 중 분석 대상 성분의 추출 용매로는 acetonitrile을 이용하는데, 여기에 다량의 NaCl, MgSO4 등의 염을 첨가하여, 고농도의 염과 극성 방해물질을 포함하는 수층과 분석 대상 성분을 포함하는 acetonitrile 층의 분리를 유도한다. 이렇게 취해진 acetonitirle 층에는 유지 등의 비극성 방해물질이 분석 대상 물질과 공존하므로, C18 dSPE에 적용시켜, 이들을 정제 제거 시킨다. 시료 및 분석 대상 성분에 따라서 QuEChERS 법의 변형도 고려해 볼 수 있는데, 추출 및 LLE 시 액성 조정을 위해 acetate buffer를 사용한 경우와 citrate buffer를 사용한 경우가 그 대표적 예이다. QuEChERS 법은 분석방법이 간단하고 개발이 쉬운 장점을 가지고 있어 여러 가지 시료를 대상으로 전 세계적으로 연구되고 있으나, 기존 분석법에 비하여 적은 시료량을 사용하고, 상대적으로 불순물을 많이 가지고 있기 때문에 다운스트림 분석에 비교적 고감도 기기를 이용하여야 하는 단점이 있다. 추출은 검체 중의 분석 대상 성분을 다운스트림의 분석 방법에 용이하게 적용시키기 위해 용매 등으로 녹여내는 과정이다. 따라서, 추출 과정의 원칙은 대상성분을 효율적으로 추출하되 분석에 간섭하는 물질은 최소화하는 것이다. 분석용 검체로부터 잔류동물용의약품을 추출하기 위해서는 대상 검체의 종류 및 분석성분에 따라 다양한 방법이 사용된다. 일반적으로 잔류동물용의약품의 추출에 사용되는 방법은 기계적 진탕법 (shaking, blending, homogenization 등), Soxhlet 추출법, 초음파 추출법 (ultrasonication), 가속 용매 추출법 (accelerated solvent extraction, ASE), column 추출법, 초임계유체 추출법 (supercritical fluid extraction), 고상추출법 (solid-phase extraction, SPE) 등이 있다. 기계적 진탕법은 가장 일반적으로 사용되는 간편한 추출방법으로 분말이나 입자 크기가 작은 검체에 적용하는데, 검체와 검체에 대하여 2∼5배량의 추출용매를 Erlenmeyer flask와 같은 용기에 함께 넣고, 진탕기 (보통 200 rpm) 에서 30분 내지 수시간 진탕하여 추출한다. 분말로 만들기 힘들거나, 입자가 큰 검체는 blender 컵이나 homogenizer컵에 넣고 2∼5배량의 추출 용매를 넣은 후 1∼5분간 고속 마쇄하면서 기계적 진탕법과 동일하게 추출 과정을 적용 시키는데, 이를 각각 blending과 homogenization이라 한다. Blender의 경우 회전수가 3,600 rpm 정도면서 회전구동부가 하부에 위치한 반면, homogenizer는 회전수가 최고 10,000∼15,000 rpm으로 보다 고속이고 회전구동부가 상부에 장착되어 있는 점이 다르다. 채취한 검체는 잔류분석에 방해가 되지않는 재료를 사용하여 검체에 손상이 없도록 포장하고, 즉시 분석 실험실로 운송하여야 하는데, 24시간 내에 실험실로 운송할 수 없을 경우는 분석성분의 분해 등 검체 내 변화를 최소화하기 위하여 냉동처리 후 운반하여야 한다. 특히 부패가 빠른 시료의 경우 채취 즉시 –20°C의 상태를 유지하도록 하고, 운반과정에서도 –20°C 의 상태를 유지하여야 한다. 동물용의약품 잔류검사는 육류를 대상으로 하는 경우, 크게 도축 전 검사와 도축 후 식육에서의 잔류검사로 나누며, 도축 전 검사는 주로 뇨, 도축 후 검사는 식육, 지방, 신장 간 및 망막 등 표적장기가 주 검사시료이다. 예를 들어, 도축 전 검사의 경우, 소, 돼지, 양은 주로 뇨 5 mL 또는 혈액(혈청으로서) 1 mL 이상을 대상으로 하고, 도축 후 검사를 위해서는 일반적으로 근육의 경우, 100～500 g, 지방의 경우, 10 g 이상, 신장 및 간의 경우 50 g 이상(가금의 경우 신장 또는 간 전체)을 채취한다. 그 외 알류는 난백, 난황, 전란을, 꿀은 꿀, 벌집(소비)도 검사 대상 시료가 되며, 최근 모발도 모니터링차원의 조사 시료로 활용하고 있다.