잔류물질 분석을 위한 검체 전처리 및 GC와 HPLC의 원리 및 구성 요소에 관한 기술적 특성 doc_id PCY_201501090909516861_4

실험실에 도착한 검체는 원칙적으로 즉시 전처리하여 잔류분석용 검체를 조제한다. 식용으로 사용되는 가식부를 위주로 하나 분석 부위와 반드시 일치하는 것은 아니라는 점을 유의한다. 전처리한 분석용 검체에 대하여 즉시 잔류분석과정을 수행하는 것이 가장 바람직하지만 대부분 현실적으로 가능하지 않기 때문에 분석 시까지 검체를 보관하는 경우가 많다. 검체를 보관하는 경우에는 보관기간 중 분석성분의 분해를 방지하기 위하여 최소한 -20℃ 이하의 냉동조건을 유지하여야 하며, 특히 동물체내 효소에 의한 분해를 방지하기 위해서는 -70℃ 이하의 초저온 보관도 필요하다. 보관용기는 500∼1,000 mL정도의 유리용기가 바람직하나 파손의 우려가 있을경우 분석에 방해가 되지 않는다고 확인된 재료의 다른 용기 (polyethylene bag 등) 도 사용 가능하다. 기체크로마토그래피는 분리관 내 이동상이 기체이며 고정상이 고체 또는 액체인 분리 기술이다. 분리관 내로 주입되는 검체 혼합물 기체 중 서로 다른 화합물들은 고유의 물리적 특성에 따라 고정상에 대한 친화력에 차이를 나타내며 이에 따라 이동상/고정상간 분포비율이 달라져 서로 상이한 속도로 이동한다. 일정한 조건하에서 화합물들의 분리관을 통과하는 시간은 서로 상이하므로 정성적으로 화합물간의 분리가 일어나며 이들 물질들을 다양한 검출기를 이용하여 정량적으로 분석할 수 있다. GC는 고정상이 고체인 gas-solid chromatography (GSC)와 고정상이 액체인 gas-liquid chromatography (GLC)로 세분되는데, GLC가 휘발성 물질의 분리 분석에 매우 광범위하게 이용되며, 잔류동물용의약품의 분리 분석에도 많이 이용된다. 일반적으로 GC는 이동상 이송 장치 (대개 고압 가스실린더 및 유량조절계), 검체 주입구, 온도 조절 장치, 분리관, 검출기, 데이터 장치로 구성 된다. 대부분 액체 상태인 검체를 기체화하여 칼럼에 주입하기 위한 장치이다. 기체 검체 의 경우는 loop injector 등 전용의 주입기를 사용하기도 한다. 액체 검체는 대개 미세주사기 (micro syringe)를 사용, 이동상의 흐름에 영향을 주지 않도록 스스로 재봉합되는 실리콘 고무 재질의 격막 (septum)을 투과시켜 주입되며 고온 조건에서 빠른 속도로 기체화되어 일부 또는 전부가 분리관으로 들어간다. 검체주입구의 구조는 사용하는 분리관의 종류에 따라 모세관용 주입기 (capillary inlet) 및 충전 칼럼용 주입기 (packed inlet)의 두 종류가 있다. 충전 칼럼용 주입기는 미세주사기로 투입한 검체의 기화분 전량이 칼럼으로 주입되는 구조로 충전칼럼과 내경 0.53 mm인 모세관칼럼의 검체 주입에 사용된다. 모세관용 주입기에는 모든 모세관 칼럼을 사용할 수 있는데 split과 splitless injection의 두 가지 검체 주입방식이 있다. Split 주입방식은 미세주사기로 주입한 검체를 기화시킨 후 일부만을 칼럼으로 도입시키는 방식으로, 기화된 검체는 두 갈래의 기체 통로 즉, 칼럼으로 흐르는 이동상 기체 와 주입구 밖으로 배출되는 split vent용 기체의 유속에 따라 분배되어 일부만이 칼럼으로 주입된다. 따라서, split 주입 방식은 실제로 칼럼에 주입되는 검체량이 적어 감도가 낮게 나타나는 단점이 있다. Splitless 주입방식에서는 split vent용 기체의 흐름을 막은 상태에서 미세주사기로 검체를 주입하면 검체는 기화한 후 전량 칼럼으로 도입된다. 이때 칼럼의 온도는 검체용매 끓는점의 10℃ 이하로 낮은 온도를 유지한다. 기화된 검체는 낮은 온도로 인하여 칼럼 선단에 좁은 범위로 다시 응축된다. 일정 시간 (30∼90 초)이 지난 후 split vent용 기체를 흘리면 inlet내 용매 등 고 휘발성 성분들은 배출되고 동시에 칼럼 온도를 상승시키면 칼럼 선단의 용매가 빠르게 이동하면서 휘발성이 낮은 성분들을 좁은 범위로 농축한다. 칼럼 온도를 점차 상승시키면 저휘발성 성분들이 서서히 이동하면서 분리가 시작된다. GC에서 사용되는 분리관은 충전제로 채워져 있는 충전칼럼 (packed column)과 모세관칼럼 (capillary column)의 형태로 대별된다. 충전칼럼은 유리나 스테인리스 스틸 재질로 제작된 관에 적절한 고정상을 충전한 형태이다. 충전제로는 GSC의 경우 다공성 polymer, GLC의 경우는 불활성의 담체 (solid support)에 silicon oil 등 다양한 특성의 고분자 액체 (liquid phase)를 1∼10% 정도로 피복하여 사용한다. 모세관 칼럼에 비하여 많은 양의 검체를 주입할 수 있고 재현성도 우수한 장점은 있으나 열분해나 흡착정도가 크고 무엇보다도 분리효율이 열등하여 최근에는 일부 GSC 및 단성분 잔류분석 시를 제외하고는 모세관칼럼이 주로 사용되고 있다. 모세관칼럼으로는 fused silica로 제작된 내경 1 mm 미만, 길이 10∼100 m의 가는 관이 분리관으로 사용된다. 고정상은 충전되어 있는 것이 아니라 liquid phase를 분리관 벽면에 피복 (wall coated) 또는 화학적으로 결합 (chemically bonded)시킨 형태인데, 피복 (wall coated)의 경우 고온에서의 bleeding (liquid phase가 유출되는 현상)이 과다한 단점이 있어 최근의 칼럼은 거의 모두 화학적 결합 형태이다. 모세관칼럼에서는 충전제에 의한 다경로 현상이 없어 van Deemter equation은 HETP = B/μ + C.μ로 표시된다. 또한 충전제가 없으므로 분리관 내 이동상을 흘릴 때 일어나는 압력 강하가 적어 분리관 길이를 길게 할 수 있다. 따라서 모세관칼럼의 이론 단수는 보통 충전칼럼의 수십 배에 달할 정도로 칼럼효율이 높다. 보통의 일상적 분석에는 15∼30 m 길이의 칼럼으로 충분하며 특별히 고분리능이 요구될 때에는 60m 이상의 칼럼도 간혹 사용된다. 내경이 작은 0.25 및 0.32 mm 모세관 칼럼은 분리능은 매우 우수하나 허용 검체량이 매우 적은 단점이 있다. 따라서 분석자가 주입한 검체량과 칼럼 내로의 실제로 주입되는 검체량을 분배 하거나 휘발성 차이에 따른 화합물 군을 선별적으로 주입하는 전용의 검체주입장치를 사용하여야 하며 재현성이 다소 낮다. HPLC로 분석할 수 있는 화합물은 GC와는 달리 비휘발성 화합물들이다. 휘발성이 너무 강한 기체 또는 저분자 화합물들은 이동상 중에서 기화, bubble을 형성하여 이동상의 흐름 자체를 방해하기 때문에 HPLC로 분석하기 어렵다. HPLC는 GC와는 달리 상온 또는 대개 50℃ 이하의 저온 분석조건이므로 열분해에 취약한 화합물들의 분석에는 아무 문제가 없다. 특히 대상 성분의 극성 정도를 고려하여 역상 및 순상의 선택 적용이 가능하고, 이온 및 해리하는 작용기를 보유한 분자들도 LLC 양식에서 ion-suppression이나 ion-pair 기술을 이용하거나 ion-exchange 양식으로 분리가 가능하다. 따라서, HPLC 적용 가능한 물질의 범위는 매우 넓다. 일반적으로 HPLC는 이동상 이송 장치 (solvent delivery pump), 검체 주입 장치, 분리관, 검출기, 데이터 장치로 구성 되고, 온도 조절 장치가 추가될 수 있다. 이는 GC의 기기 구성과 매우 유사하나, 개별 부분의 특성은 GC와 매우 상이하다.