식품 내 잔류 동물용의약품의 효율적이고 신뢰성 있는 분석을 위한 기기 분석법(UHPLC, MS/MS 등)의 적용과 스크리닝 및 확인 분석의 원리 및 검증 방법 doc_id PCY_201501090909516861_6

또한, 다수의 시료에 함유되어 있는 여러 가지 성분을 빠른 시간내에 분석하여야하는 스크리닝 분석의 특성을 고려하여 일반적인 HPLC 보다 분리 효율이 뛰어난 UHPLC를 이용하여 모든 성분이 10분 이내에 분리되도록 분석법을 설정하였다. UHPLC에서는 보통 2 μm 미만의 particle size를 갖는 칼럼을 사용한다. 이는 시료 및 이동상에서 유래한 미세한 particle에 의하여 막힐 수 있으므로 조제 시 0.2 μm의 membrane filter를 사용해 여과하여 particle의 유입을 방지한다. 분석대상인 45종 동물용의약품의 검출에는 triple quadrupole mass spectrometer 를 사용하였다. 분석 대상인 항생제들의 구조 및 물리화학적 특성이 다양하여 ESI positive ion mode 또는 negative ion mode 중 한 종류의 ion mode를 이용할 경우 분석 물질을 모두 검출할 수 없다. 따라서 triple quadrupole을 사용하여 분석할 경우 polarity switching을 사용하여 한번의 분석으로 모든 분석물질을 검출할 수 있도록 설정하고 MRM을 사용하여 분석의 선택성을 높였다. 식품 중 잔류동물용의약품 분석은 미량 분석에 해당 되므로, 기본적으로 높은 감도의 분석 방법만이 적용될 수 있다. 이 외에도 복잡한 시료 상태를 고려하여 선택성이 있는 방법이 선호 되고, 법적, 행정적 이용과 관련되어 재현성 및 실용성 (유지관리) 이 해당 방법에 요구된다. 따라서, 이상의 특성을 종합해 봤을 때, 시료 분리 능력이 우수하고, 다양한 고감도의 선택적 검출기의 적용이 가능한 GC와 HPLC가 식품 중 잔류동물용의약품 분석을 위한 최적의 기기 분석 방법으로 인정 받고 있다. 그러나, 머무름 시간에 기반한 정성 분석의 신뢰도에 의문이 제기됨에 따라, 최근에 와서는 GC와 HPLC의 검출기로 분자량 및 화학 구조에 관한 정보도 획득이 가능한 질량 분석기를 적용시키는 GC-MS(/MS), LC-MS(/MS)의 사용도 확대 되고 있다. GC-MS(/MS) 또는 LC-MS(/MS)에 기반한 방법은 신뢰도 높은 정성 분석 능력으로 인해, 검체 중 검출된 성분의 재확인법으로 널리 이용되고 있는 관계로, 이들에 기반한 분석 방법의 경우, 추가적인 재확인 과정이 필요 없다는 장점도 가지고 있다. 푸리에변환 적외선 분광광도법 (Fourier transform infrared spectroscopy)이나 질량분석법 (mass spectrometry) 등은 자체적으로 충분히 선택적이고 특이적인 정성 확인을 제공한다. 이러한 분석법은 주로 확인 분석법 (confirmatory method)으로 사용되기도 한다. 정량 분석법이 충분히 특이적이지 못할 때 확인 분석법으로의 정성이 주로 필요하게 된다. 스크리닝 분석법의 특이성은 보통 정량 분석법보다는 크지 않다. 왜냐하면 스크리닝 분석법은 화합물 그룹이나 클래스의 구조적인 유사성을 이용하기 때문이다. Biological assay, immunoassay 또는 chromogenic 반응을 기반으로한 기술들은 명확한 정성이 가능한 기술보다는 특이적이지 않다. 스크리닝 분석법의 특이성은 크로마토그래피나 다른 분리 기술의 사용으로 증가될 수 있다. 기기로부터 수집된 noise는 전기적이거나, 화학물질에 의해 생성되는 원치 않는 signal 이다. baseline noise의 경우 분석자가 filtering이나 smoothing을 통해 쉽게 제거할 수 있지만, 분석 대상화합물의 peak 에도 영향을 미치므로 결국 정량에 영향을 미친다. 크로마토그래피에서 주입된 양은 모두 칼럼을 통해 나온다는 가설아래 대부분의 검출기 신호 수집 이후 정량은 peak의 면적(area)으로 계산하는 것이 보편화 되어있는 반면, noise의 측정은 신호의 세기, 혹은 감도(sensitivity)로 확인하므로 peak height로 측정 해 왔다. S/N ratio는 분석대상물질의 기기상의 검출한계(instrumental detection limit)를 산출하는 가장기본적인 요소이다. S/N ratio는 정성적 검출과 정량적 검출의 수준을 결정하는 요소이나, 그 측정방법에 있어 국제적인 표준은 없다. S/N ratio의 측정에 대한 통계적 논리와 원리에 대해 많은 논쟁이 있어 왔지만, 지금은 대부분 S/N ratio를 S/N로서 산출하는 것이 보편화 되어 있다. 검출한계(LOD, limit of detection)는 분석조작의 전 과정을 통하여 시료에 포함된 분석성분을 기기상으로 명확히 판별할 수 있는 최저 농도를 말하는데 채택한 분석법에서 분석에 사용된 시료 양, 함유농도 그리고 농축비율에 따라 차이가 날 수 있다. 가스크로마토그래피를 이용한 경우의 검출 한계 계산 방법은 다음과 같다. 가스크로마토그라피의 chromatogram상에서 분석대상 물질의 표준물질로 작성한 검량선상의 가장 낮은 양 즉 검량 분석대상 성분의 peak를 명확하게 인정할 수 있는 양을 최소검출량으로 잡아서 A ng으로 나타낸다. 분석에 사용된 대표 시료의 양을 B gram으로 하고, 시료에서 분석성분을 추출, 분배 및 정제하여 가스크로마토그라피에 주입하기 전 최종적인 추출 시료용액의 양을 C 그리고 가스크로마토그라피에 주입한 시료의 양을 D 라고 할 때 검출 한계 LOD(mg/kg)은 다음 식에 의하여 얻어진다. 분석대상인 65종 항생제의 검출에는 triple quadrupole mass spectrometer 와 high resolution mass spectrometer인 Q-TOF를 사용하였다. 분석 대상인 항생제들의 구조 및 물리화학적 특성이 다양하여 ESI positive ion mode 또는 negative ion mode 중 한 종류의 ion mode를 이용할 경우 분석 물질을 모두 검출할 수 없다. 따라서 triple quadrupole을 사용하여 분석할 경우 polarity switching을 사용하여 한번의 분석으로 모든 분석물질을 검출할 수 있도록 설정하고 MRM을 사용하여 분석의 선택성을 높였다. 하지만 분석법 개발에 사용된 Q-TOF의 경우 빠른 polarity switching이 불가능하여 positive ion mode와 negative ion mode를 나누어 분석하였다. 스크리닝 분석은 threshold 또는 cut-off 수치 이상의 목적 성분을 함유하는 샘플 (“positive")과 목적 성분을 함유하지 않는 샘플 ("negative")을 구분하기 위한 실험이다. 따라서 스크리닝 분석법의 검증 시, 역치 농도 (threshold concentration)를 확립하는 것에 초점을 맞춰야 한다. 역치 농도는 MRL보다 작거나 같아야 하고, 작을수록 스크리닝 분석의 신뢰도가 높아진다. 본 분석법의 역치농도는 MRL의 1/2 농도를 기준으로 설정하였다. - 확인 분석은 일반적으로 4점 이상의 identification points (IPs)를 필요로 한다. 본 분석법은 정성이온과 정량이온을 모두 검출하도록 설정하여 4점의 IPs를 가지며, 추가로 high-resolution mass spectrometer인 Q-TOF을 사용한 분석조건을 확립하여 검출된 성분의 accurate mass를 이용하여 물질을 확인할 수 있는 분석법을 확립하였다.